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稳定细胞株筛选
常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天。在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β-半乳糖苷酶等来帮助检测。后者外源质粒DNA整合到宿主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因及蛋白。需要在瞬时转染基础上对靶细胞进行筛选。建立稳定的细胞系,是根据不同基;因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物对靶细胞进行筛选。最常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用HygromycinB、G418和puromycin进行选择性筛选。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白,用于蛋白的扩增和富集;或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

上海生博提供:载体构建服务,或对已构建好的外源质粒DNA进行稳定筛选。针对质粒DNA的抗性标志,选择相应的药物,并对所需筛选的细胞进行药物测试,选择细胞全部凋亡时药物的最低浓度。瞬时转染或者慢病毒感染细胞后,在适当的药物浓度条件下进行细胞筛选。10-14天后,挑取单克隆,扩增后通过RT-PCR检测mRNA表达情况或客户提供靶基因特异性抗体,上海生博提供WesternBlot检测,根据蛋白表达情况,进一步筛选出稳定细胞株。
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